Gabriella Ribeiro Ramos
Orientador: Marcelo Hermes-Lima
“Estresse
Oxidativo e Hipometabolismo em Gastrópodes Helix aspersa maxima”.
.
Resumo
Durante
a transição entre períodos de anóxia/hipóxia e reoxigenação ocorre aumento da
pressão de oxigênio celular, levando a uma maior geração de espécies reativas
de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo (Gonzalez-Flecha e Demple, J. Biol
Chem, 270: 13681, 1995). Durante condições de hipometabolismo, como na
estivação do gastrópode terrestre Otala lactea, ocorre hipóxia nos
órgãos internos, seguido por um aumento na peroxidação lipídica quando a taxa
metabólica retorna ao normal (Hermes-Lima e Storey, Am. J. Physiol.,
268: R1386, 1995).
Neste trabalho, estudou-se o sistema de
defesa antioxidante enzimático (seis enzimas antioxidantes) e não enzimático
(glutationa reduzida - GSH e glutationa oxidada - GSSG) em gastrópodes Helix
aspersa maxima durante um período de 20 dias em estivação, 24 horas ativo
(após a estivação) e a transição entre estas duas condições, no período do
despertar. Foram ainda determinados os indicadores de estresse oxidativo: razão
GSSG/GSHeq (GSHeq = GSH + 2 GSSG), proteínas oxidadas (quantificação de
proteínas carboniladas) e peroxidação lipídica pelo método clássico do TBARS e
pela técnica de lipoperóxidos reativos com o complexo alaranjado de
xilenol-Fe(II). Os animais foram estudados em duas épocas do ano diferente e
analisou-se dois órgãos, hepatopâncreas e o músculo do pé.
No período de janeiro/março, o
hepatopâncreas do animal em estivação apresentou uma redução na atividade das
enzimas catalase e superóxido dismutase (SOD) de 32% e 39%, respectivamente,
enquanto a atividade da glutationa peroxidase (GPx) subiu 268%. As atividades
de glutationa redutase, glutationa S-transferase e glicose-6-fosfato
desidrogenase mantiveram-se inalteradas, assim como os níveis de TBARS. No pé,
nenhuma variação entre atividades enzimáticas ou níveis de TBARS foi
encontrada.
Durante
o mês de junho, a atividade de GPx aumentou 387% no hepatopâncreas e 199% no pé
durante a estivação. As outras enzimas mantiveram-se com atividades constantes
em ambos os órgãos. A concentração de glutationa total (GSH-eq) aumentou 82% no
hepatopâncreas durante a estivação. Foram detectados ainda aumentos de
peroxidação lipídica (TBARS: 83%; lipoperóxidos: 361%) no hepatopâncreas e de
proteínas carboniladas (56%) no pé de animais em estivação. Pôde-se observar
ainda, aumento dos níveis de TBARS e da razão GSSG/GSHeq no hepatopâncreas, com
15-30 minutos do processo de despertar da estivação. Isto indicou a ocorrência
de estresse oxidativo na transição hipometabolismo-metabolismo normal no mês de
junho.
Em estudos
preliminares de biologia molecular, clonamos e sequenciamos, a partir do
hepatopâncreas, um fragmento de 720bp que apresentou homologia de 60 à 67% com
outras seqüências de catalase já descritas. O fragmento obtido deve
corresponder a cerca de 40-45% da seqüência total.
Os
resultados mostraram que, em junho, H. aspersa passa por um estresse
oxidativo durante a transição hipometabolismo-metabolismo normal e que para
minimizar os danos oxidativos nestas condições, o animal modifica a atividade
de seu sistema de defesa antioxidante endógeno. No período de janeiro/março, os
resultados também mostram que ocorre uma modulação nas atividades de enzimas
antioxidantes de H. aspersa,
podendo servir para inibir processos oxidativos deletérios durante o
despertar. Analisando os resultados como um todo, propomos que o caramujo
utilize o mecanismo de “preparo para o estresse oxidativo” durante a estivação
(Hermes-Lima et al. Comp. Biochem. Physiol. 120B: 437, 1998) como forma de controlar os efeitos
deletérios de EROs formadas no processo de transição
hipometabolismo-metabolismo normal. Outros animais, dentre eles rãs, cobras e
peixes, também adotam esta estratégia para sobreviverem a condições de
hipóxia/anóxia, seguido por reoxigenação.
Ainda
não conhecemos as bases moleculares que modulam a atividade do sistema de
defesa antioxidante, mas devem envolver EROs como segundos mensageiros e um
sistema sensor de oxigênio e/ou estado redox intracelular.
During the transition from a period
of anoxia/hypoxia to reoxygenation there is an increase in intracellular oxygen
tension, leading to a major production of oxygen reactive oxygen species and
oxidative stress (Gonzalez-Flecha and Demple, J.Biol.Chem, 270: 13681,
1995). During hypometabolic conditions, such as estivation of terrestrial
gastropods, internal organs become hypoxic. Moreover, Hermes-Lima and Storey (Am.
J. Physiol., 268: R1386, 1995) detected an increase in lipid peroxidation
in land snails Otala lactea during the transition from hypometabolism to
active metabolism.
Throughout this dissertation, we
studied the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defense system (reduced and
oxidized glutathione, GSH and GSSG, and six antioxidant enzymes) of the
terrestrial gastropod Helix aspersa maxima after 20 days of estivation,
24 h in active metabolism (after estivation) and during arousal (the transition
from hypometabolism to active metabolism). Some oxidative stress indicators
were also determinated: ratio of GSSG/GSHeq (GSHeq = GSH + 2 GSSG), oxidized
proteins (carbonyl protein determination) and lipid peroxidation by the classic
method of TBARS and the technique of reactive lipoperoxides with Fe(II)-xylenol
orange complex. The study was performed in two distinctive periods of the year
and two organs were analyzed (hepatopancreas and foot muscle).
During January-March
the activity of the enzymes catalase and superoxide dismutase (SOD) decreased
by 32% and 39%, respectively, after 20 days of estivation. Glutathione
peroxidase (GPx) activity from hepatopancreas also increased by 268% during
estivation. In addition, the activities of glutathione reductase, glutathione
S-transferase and glucose-6-phosphate were unaffected. In foot muscle, no
changes were observed in the enzymatic activities and the levels of TBARS.
During June the
activity of GPx activity increased by 387% in hepatopancreas and 199% in foot
muscle after 20 days of estivation. The other enzyme activities were unchanged
in both organs. The concentration of total glutathione (GSHeq) in
hepatopancreas was increased by 82% during estivation. We also observed
relevant increases in lipid peroxidation (TBARS: 83%; lipoperoxides: 361%) in
hepatopancreas and in carbonyl proteins (by 56%) in foot muscle of estivating animals. Moreover, during 15–30 minutes
of arousing process, a significant increase in the levels of TBARS and
GSSG/GSH-eq ratio from hepatopancreas was noticed.
On preliminary studies
of molecular biology, we cloned and sequenced a 720bp fragment from
hepatopancreas catalase, which corresponds to 40-45% of the entire sequence.
This fragment exhibited a 60–67 % homology to other already described catalase
genes.
Our results suggested that H.
aspersa undergoes physiological oxidative stress during the transition from
hypometabolism to active metabolism in June. In these conditions, the animal
modulates its antioxidant defensive system to minimize oxidative injuries. In
the January-March period, the results suggest that the modulation of enzymatic
antioxidant activities of H. aspersa are possibly used to inhibit
oxidative processes during arousal. We propose that these H. aspersa
have a physiological mechanism of "preparation against oxidative stress”
during estivation, as proposed by Hermes-Lima et al. for other
non-mammalian species during wild transitions of oxygen concentrations and
metabolic activities (Comp. Biochem. Physiol. 120B: 437, 1998). This
biochemical mechanism may control the harmful effects of reactive oxygen
species produced during arousal in H. aspersa.
Although we do not know the
molecular bases that modulate the changes in the endogenous antioxidant system
during estivation, it might involve reactive oxygen species as second
messengers and sensors of oxygen tension and/or intracellular redox state.